由于环境污染、生活节奏加快、推迟生育年龄等因素,现代社会不孕不育患者日趋增多。不孕相关疾病的传统治疗多针对不孕的直接原因进行治疗,如输卵管性不孕行输卵管整形术,排卵障碍性不孕行药物促排卵治疗,但仍有部分患者的不孕问题无法得到解决。随着医学遗传学研究的不断深入,研究者们发现许多不孕相关疾病的发生与基因密切相关,因此通过转基因治疗或许可以在一定程度上纠正或补偿基因异常或缺陷,使部分患者获得生育能力。近年来,一些学者对转基因治疗在不孕不育中的应用进行了详细研究,本文对此研究进展作一综述。
1.转基因治疗在女性不孕相关疾病中的研究
导致女性不孕常见的疾病和因素有子宫内膜异位症(EMS)、盆腔输卵管粘连、排卵障碍、免疫因素等。
1.1EMS
EMS患者不孕率达30%~50%,造成其不孕的原因有多种可能机制:盆腔粘连、卵泡生成受限、颗粒细胞的类固醇生成减少、吞噬、受精障碍等。
子宫内膜的异位植入需要新生血管的建立、生长并侵入。因此,抗血管生成是治疗EMS的有效手段之一。Dabrosin等将表达血管增生抑制素(angiostatin)基因的缺陷型腺病毒载体(adangiostatin)注射到到14只诱导形成EMS的小鼠模型腹腔内,注射后第5日观察到子宫内膜组织明显减少,血管数量从133&plun;22个/mm2下降到68&plun;17个/mm2,差异具有统计学意义。注射2周后14只小鼠体内均没有异位子宫内膜组织残留,成功治愈EMS小鼠,但该种疗法同时也造成了一定程度的卵巢功能受损,黄体生成被抑制,雌、孕激素分泌减少,卵巢、子宫质量减轻等。内皮抑素(endostatin,ES)是目前已知的作用效果最强的血管生成抑制剂,Ma等将携带有ES基因的腺病毒载体(Ad-ES)注射到EMS的裸鼠模型体内后观察到,与对照组相比,转基因组裸鼠体内的EMS病灶及微血管密度明显减小,细胞凋亡加快。国内有学者在大鼠模型上也得到了类似的结果。Zhao等通过硬脂酸-壳寡糖(CSO-SA)纳米胶束作为载体将能够诱导内皮细胞凋亡、抑制内皮细胞迁移和血管新生的色素内皮细胞衍生因子(PEDF)基因转到EMS大鼠体内后,也较好地治疗了EMS。可见,通过转基因抗血管生成从而治疗EMS具有一定的应用前景。
生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白家族成员,在凋亡抑制中具有关键性作用。研究表明,EMS患者异位内膜中生存素高表达,意味着其可能在EMS的发展中起着重要的作用,使异位内膜组织逃避凋亡机制,促进细胞增殖。彭冬先等设计了靶向生存素基因的shRNA重组慢病毒载体(LV-survivin-shRNA),将其感染至鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)EMS血管生成模型中,结果显示LV-survivin-shRNA能够显著抑制CAM模型上异位种植的人子宫内膜新生血管形成,促进异位种植内膜细胞的凋亡,从而抑制子宫内膜在CAM上的种植生长。
1.2盆腔、输卵管粘连
炎症或盆腔手术史易导致盆腔、输卵管粘连,影响卵子与的结合,导致不孕。粘连的发病机制涉及3个重要的环节:①创伤抑制纤溶系统和细胞外基质(ECM)降解系统;②创伤及异物引发炎症反应,产生细胞因子如转化生长因子-β(TGF-β)等;③创伤引起组织缺氧,导致缺氧诱导因子-1α(HIF1α)和血管内皮生长因子(VEGF)表达增加,促进胶原蛋白和血管形成。
针对以上环节,研究者们使用不同的载体和靶基因对治疗粘连进行了探索。Atta等将编*****了人类组织纤溶酶原激活物(htPA)基因的腺病毒载体(Ad-htPA)注入腹膜损伤后的小鼠腹腔内,与对照组进行比较后显示小鼠腹腔的粘连程度明显减轻,纤溶酶原抑制剂的产量减少。Guo等通过非病毒性超声微泡介导裸基因转染系统将编*****形成纤维化的重要蛋白质ad7的基因转到腹腔磨损的大鼠模型腹腔内,4周后观察到经过转基因治疗的大鼠,腹腔粘连的发生率和严重程度均显著降低,纤维化因子出现降节,ad2/3的活化被抑制。鞘氨醇激酶(SPK)是参与调节细胞增殖和迁移的信号转导分子,它的活性增高有利于间皮细胞的修复,防止粘连的形成。Guo等将腺病毒介导的SPK-1基因(Ad-SPK1)转染至子宫角损伤的大鼠腹腔内,2周后观察到转染后的大鼠间皮细胞更大程度地迁移和分散至伤口处,特别是创伤边缘。粘连程度与对照组相比明显减轻,子宫角处的细胞层次清晰,未见浆膜层明显增厚。Segura等通过RNA干扰技术使子宫角损伤的大鼠体内HIF-1α和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)1基因的表达下调,使大鼠术后粘连的发生率下降了约50%。肝细胞生长因子(HGF)是一种多功能的细胞因子,包括间皮细胞在内的各型细胞增殖和迁移。Liu等将腺病毒介导的HGF基因转染至腹腔损伤的大鼠体内,也减轻了腹腔粘连的形成。通过靶向不同的基因,针对粘连发生的不同环节,转基因有效地降低了动物模型粘连的发生率,其有望成为预防盆腔及输卵管粘连的新疗法。
另外,研究者们还对不同载体的转基因效率进行了比较。Nair等将几种不同的转导和转录修饰腺病毒注射到人类黏附成纤维细胞内,结果显示纤维修饰病毒Ad5-Sigma-luc比Ad5-RGD-luc、Ad5/3-luc和Ad5-CAV2-luc在粘连细胞中表达效率高,转录靶向病毒Ad5-mesothelin(MSLN)-CRAdluc比Ad5-survivin-luc,Ad5-heparanase-luc和Ad5secretoryleukoproteaseinhibitor(SLPI)-luc效率高,表明经过特殊修饰后的腺病毒载体Ad5-Sigma-luc和Ad5-mesothelin(MSLN)-CRAd-luc可以提高组织纤溶酶原激活物(tPA)等治疗基因在腹膜粘连细胞内的传递效率。
1.3排卵障碍
各种因内分泌系统紊乱或者异常引起的排卵障碍也是女性不孕的主要因素。卵巢早衰(prematureovarianfailure,POF)是以卵泡耗竭为表现的一种排卵障碍。研究表明,卵泡素受体(FSHR)基因的第566位点由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T),即C566T突变与POF相关。Ghadami等选择FSHR敲除(follitropinreceptorknockout,FORKO)的雌性小鼠作为POF的动物模型进行了外源性FSHR基因导入治疗POF的研究,他们用携带人类FSHR基因的腺病毒(Ad-hFSHR)转染FORKO小鼠作为实验组,携带LacZ的腺病毒(Ad-LacZ)转染的FORKO小鼠为对照组,6~10周后检测到实验组小鼠生殖系统内出现正常的FSHR表达,分泌物涂片可见雌激素改变,血清雌激素升高了2~3倍,FSH水平下降了40%~50%,组织学检查见卵巢内平均有26&plun;4个卵泡,其中8&plun;2个窦卵泡;而对照组小鼠雌激素水平无明显变化,卵巢内仅有5&plun;2个卵泡,0个窦卵泡;组间小鼠血清孕激素水平均无变化。研究者给所有小鼠均注射了血清(PMSG)和人绒毛膜(hCG),但12周的实验期内未见到排出的卵子或黄体,交配后也无小鼠妊娠。
1.4免疫性不孕
子宫内膜局部存在大量的免疫细胞,在胚胎种植中起着重要的作用。正常情况下,母体免疫系统能够进行相应的免疫调节,对胎儿产生免疫耐受。当母体子宫内膜局部的免疫细胞,如T细胞、B细胞或自然杀伤(NK)细胞等功能异常时可能影响正常的妊娠过程,表现为复发性流产、反复种植失败等。因此,通过在体内转入相应基因抑制免疫因子的产生,诱导形成免疫耐受,可以改善该类不孕疾病的妊娠结局。对此,国内外学者进行了相应的研究。细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)是一种白细胞分化抗原,也是一种免疫调节的负因子。Li等将携带有重组CTLA-4(CTLA4Ig)基因的腺病毒(Ad-CTLA4Ig)转染至小鼠流产模型体内后,CTLA4Ig通过提高CD4+CD25+调节T细胞的数量和诱导吲哚胺2,3-双加氧酶产生,使实验小鼠的流产率显著下降。类似的,流产小鼠在转染了具有抗氧化、抗炎、免疫调节等作用的血红素氧化酶(HO)1基因后,妊娠结局也得到了改善。FasL与其受体Fas结合可诱导Fas阳性的T细胞凋亡,使T细胞对胎儿抗原产生免疫耐受。熊苗等构建了携带有鼠源FasL(mFasL)的树突状细胞(mFasL-DC)载体,将其转输至CBA/J母鼠体内,使孕鼠的胚胎丢失率明显低于其他流产模型组,接近于正常妊娠模型组,因此认为过继转移mFasL-DC能诱导妊娠免疫耐受,降低自然流产模型孕鼠胚胎丢失率。
1.5卵子异常
高龄妇女在不孕治疗中常伴随着流产、反复种植失败等问题,而卵子异常是导致其不良妊娠结局的重要因素。随着年龄的增长,卵母细胞的线粒体DNA(mtDNA)功能及数目逐渐下降,进而影响卵母细胞及胚胎的质量。因此,mtDNA替代技术,即将患者卵细胞的遗传物质转移到拥有健康线粒体的捐赠者卵子内,可以解决由于mtDNA缺陷所导致的卵子质量不佳问题。
线粒体替代治疗包括原核移植、纺锤体移植和极体移植等。Wang等在小鼠模型上比较了不同的线粒体替代治疗方法,结果显示极体移植与纺锤体移植和原核移植相比,所携带的患者mtDNA最少,能够最大化地减少患者mtDNA的传递,并且通过显微镜能够很清楚地看到极体,使用微量吸液管移植时能避免染色体的丢失。该实验通过极体移植获得了正常受精的胚胎,并且最终发育成了活的小鼠后代。mtDNA替代的转基因技术为高龄妇女的生育问题提供了一线生机。
2.转基因治疗在男性不育相关疾病中的研究
男性不育多与异常相关,常见导致男性不育的疾病有无症、少弱畸型症、免疫性不育等。
2.1异常
异常包括数目和质量上异常,轻度异常一般不影响生育,重度异常如无症、畸型症、严重少弱症等则可导致不育。Sl/Sld突变小鼠支持体细胞表面缺乏跨膜型c-kit配体(KL2)表达而导致生成障碍,因此常常被用作男性不育研究的动物模型。
Kanatsu-Shinohara等认为,睾丸支持细胞与生殖细胞间的相互影响在的发生中起着重要的作用,为了治疗由于支持细胞功能障碍引起的男性不育,他们将支持细胞基因通过腺病毒载体转染到Sl/Sld突变的不育小鼠睾丸内,被转染的睾丸中有30%恢复了部分生精功能,7.4%含有成熟的,0.11%的生精小管进行了完全的发生,虽然这些雄性小鼠仍然不育,但是其睾丸内取出的圆形和成熟通过卵胞质内单注射(ICSI)可以发育成正常的具有繁殖能力的后代,这些后代均未检测到腺病毒DNA的传递。
Ikawa等用携带支持细胞基因的慢病毒转染Sl/Sld突变小鼠的睾丸后也观察到了发生的恢复,并且从睾丸内收集的成熟进行ICSI后获得了正常的后代。该实验还同时比较了重组腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒转染支持细胞基因至小鼠睾丸内的效率,结果显示腺相关病毒和逆转录病毒转染不能使睾丸内的发生恢复,而腺病毒虽然也能使发生恢复,但却造成了睾丸体积的减少,与对照组相比体积减小了约1/3,提示腺病毒本身存在一定的毒性,会对睾丸组织造成损伤。因此认为慢病毒可以作为合适且安全的载体用于男性不育的基因治疗。
2.2免疫性不育
正常情况下男性睾丸中存在着血睾屏障,从而使得男性的免受人体免疫系统的损害,但当各种原因造成血睾屏障破坏时,会使得自身的免疫系统对中的抗原产生免疫反应,从而影响的正常形态及功能,导致男性不育。实验性自身免疫性睾丸炎(experimentalautoimmuneorchitis,EAO)小鼠是一种男性免疫性不育的动物模型,迟发型超敏反应(delayed-typehypersensitivity,DTH)是其发生的关键因素。抗原特异性的DTH是由T细胞介导的细胞免疫引起的,CD4+Th1细胞及其产生的细胞因子干扰素γ(IFN-γ)、白介素(IL)-2等在DTH的发生中起重要作用。IL-10是由小鼠CD4+Th2细胞产生的具有抑制包括IFN-γ、IL-2在内的促炎细胞因子作用的免疫调节因子。为了验证IL-10是否能够抑制睾丸自身免疫炎症,Watanabe等将编*****有人类IL-10(hIL-10)的腺病毒载体注射到单侧睾丸受损致敏后的C3H/He小鼠肌肉内,观察到血清hIL-10出现于注射后的1周,在第3周时达到高峰,组织学检查显示经载有hIL-10基因的腺病毒注射治疗的小鼠睾丸炎和发生干扰现象的发生率明显降低,并且对睾丸固有细胞的迟发型超敏反应也被抑制,免疫组织化学分析显示脾和睾丸内IFN-γ、IL-2和T细胞相关因子表达亦明显减少,因此认为单一肌内注射编*****hIL10的腺病毒载体通过调节睾丸中细胞介导的免疫反应显著抑制了EAO和生成不足。
3.结束语
在不孕相关疾病的研究中,转基因治疗为部分患者带来了曙光,有望成为治疗与基因异常相关的不孕疾病的新策略。但现阶段转基因治疗仍处于初始阶段,应用范围有限,并且其体内研究均使用的动物模型,因涉及到伦理及潜在的安全问题限制了其在人体的直接应用。如果受体细胞为生殖细胞,如卵细胞质线粒体置换,该技术将使除父母以外的第三方遗传信息传递给后代,对相关个体及人类基因库都会产生持续的影响。如果受体细胞为体细胞,由于导入系统尚不成熟,载体结构不稳定,治疗基因可能难以准确到达靶细胞,且可控性差,逆转录病毒进入宿主以后有可能激活自身而引起感染,或激活其他致病基因引发癌变等。因此,转基因治疗不孕相关疾病还面临着许多挑战,在今后的研究中,希望可以从转基因治疗的角度进一步探索治疗不孕疾病的新方法,推动医学技术的发展。
