目的
分析本院儿科假丝酵母菌血流感染的临床分布、菌种分布和耐药性，为临床有效预防和治疗提供参考依据。
方法
收集2009年1月至2015年12月儿科住院患者的血液标本，经BacT/ALERT 3D全自动血培养仪培养，沙保罗培养基分离培养，柯玛嘉显色培养基，API 20CAUX酵母样真菌鉴定板和VITEK-2 compact YST卡进行菌种鉴定，药敏试验采用ATB FUNGUS 3微量稀释板，总结并分析患儿的临床资料。
结果
分离出的176株假丝酵母菌中，来自新生儿92株(52.3%)，来自PICU 46株(26.1%)。新生儿组中早产儿85株，其中低和极低出生体重儿37株、新生儿肺炎20株、新生儿呼吸窘迫综合征9株;PICU以重症感染患儿为主，年龄2 d～13岁，平均11个月。176株假丝酵母菌中，白假丝酵母菌71株(40.3%)，近平滑假丝酵母菌62株(35.2%)，光滑假丝酵母菌16株(9.1%)，热带假丝酵母菌9株(5.1%)，其他假丝酵母菌18株(10.2%)。
结论
假丝酵母菌血流感染可发生于各年龄段，以早产儿和PICU重症感染患儿为主;菌种以白假丝酵母菌为主，近平滑假丝酵母菌次之，除光滑假丝酵母菌外，其他菌种对氟康唑等常用抗真菌药物敏感率>93%，临床上选择抗真菌治疗时要考虑假丝酵母菌的菌种类别。
近年来随着广谱抗菌药物、免疫抑制剂和糖皮质激素在临床的大量应用，以及人工呼吸机、留置导管等各种侵入性诊疗技术的增多，使得侵袭性真菌感染逐年上升，临床上血液真菌感染日趋常见[1]，已引起广泛**************。在新生儿时期，侵袭性真菌感染因缺少特异性的临床表现，因此可能因延误诊断而错过治疗的最佳时机，从而导致患儿严重的并发症甚至死亡[2]。PICU患儿多为重症感染或基础疾病严重，导致机体免疫力低下，使其成为高危易感人群，有些患儿病情进展迅速，病死率高。研究显示，危重患儿念珠菌感染的病死率高达48.9%[3]。为了解我院儿童患者血液假丝酵母菌感染的临床分布、菌种分布及常用抗真菌药物敏感性特点，对本院2009年1月至2015年12月7年间从儿科血培养标本中分离出的176株假丝酵母菌进行分析，为临床抗真菌治疗提供合理依据。
1 对象与方法
1.1 研究对象
收集2009年1月至2015年12月我院临床儿科送检的门诊和住院患者的血培养标本，分离出176株假丝酵母菌，分析患儿的科室、年龄、疾病类型和菌种分布。
1.2 主要仪器与试剂
1.2.1 仪器
BacT/ALERT 3D全自动血培养仪和VITEK-2 compact 全自动细菌鉴定分析仪，购自法国生物梅里埃公司。
1.2.2 分离鉴定培养基
沙保罗琼脂培养基，科玛嘉显色培养基，API20CAUX酵母样真菌鉴定板，YST酵母菌鉴定卡均购自法国生物梅里埃公司。
1.2.3 药敏培养基
ATB FUNGUS 3真菌药敏微量稀释板购自法国生物梅里埃公司。
1.2.4 抗真菌药物
氟康唑，两性霉素B，5-氟胞嘧啶，伊曲康唑，伏立康唑。
1.3 质控菌株
近平滑假丝酵母菌ATCC22019，白假丝酵母菌
1.4 方法
1.4.1 分离培养
临床送检的血细菌培养、血真菌培养瓶阳性标本报警后，记录阳性报警时间并直接膜涂片，行革兰染色镜检观察到真菌孢子或菌丝后，接种到沙保罗琼脂和科玛嘉念珠菌显色培养基，(35&plun;1) ℃孵箱中24～48 h。
1.4.2 菌种鉴定
科玛嘉念珠菌显色培养基生长翠绿色为白假丝酵母菌，蓝色为热带假丝酵母菌，紫色为光滑假丝酵母菌，粉红色、边缘模糊且有绒毛为克柔假丝酵母菌，无色或颜色不明显用API20CAUX酵母样真菌鉴定板或VITEK YST酵母菌鉴定卡鉴定到种。
1.4.3 药敏试验
采用ATB FUNGUS 3真菌药敏微量稀释板检测5种抗真菌药物的最小抑菌浓度。药敏结果依据美国CLSI标准判读。
1.5 统计学方法
采用WHONET 5.6软件进行统计分析。
2 结果
2.1 菌株分布
7年间儿科共送检血液标本62 356份，共分离出176株假丝酵母菌，其中白假丝酵母菌71株(40.3%)，近平滑假丝酵母菌62株(35.2%)，光滑假丝酵母菌16株(9.1%)，热带假丝酵母菌9株(5.1%)，其他假丝酵母菌18株(10.2%)(分别为克柔假丝酵母菌5株，新生隐球菌4株，无名假丝酵母菌2株，黑马朗假丝酵母菌2株，高里假丝酵母菌2株，阿萨丝孢酵母1株，酿酒假丝酵母菌1株，解脂假丝酵母菌1株)。
2.2 血培养阳性报警时间
176株假丝酵母菌阳性报警时间为(36.17&plun;19.69) h;白假丝酵母菌阳性报警时间为(34.15&plun;20.88) h，最短15.21 h，最长84 h;近平滑假丝酵母菌阳性报警时间为(40.28&plun;20.24) h，最短18.96 h，最长127.6 h。
2.3 临床分布
2.3.1 科室分布
176株假丝酵母菌分离自新生儿内科92株(52.3%)，PICU 46株(26.1%)，新生儿外科15株(8.5%)，其他儿科科室23株，包括儿科呼吸病房5株，儿科血液病房5株，儿科普通外科病房4株，儿科神经病房4株，儿科肾内病房2株，儿科消化病房2株，儿科心内病房1株。
2.3.2 年龄
范围 2 d～13岁，新生儿64株(36.4%)，年龄2～29 d，平均年龄19 d;其中<1岁61株(34.6%)，年龄范围1～11个月，平均年龄3.5个月;>1岁51株(29.0%)，年龄范围1～13岁，平均年龄5.5岁。
2.3.3 疾病种类分布
新生儿内科92株，早产儿85株(92.4%);早产儿中低出生体重儿7株(8.2%)、极低出生体重儿30株(35.3%)，新生儿肺炎20株(23.5%)、新生儿呼吸窘迫综合征9株(10.6%)。92例新生儿病例均行机械通气治疗，均行深静脉置管，均在真菌感染前使用过2种以上广谱抗生素，包括注射用头孢他啶，注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠，泰能，美平，万古霉素。新生儿外科15株，包括食管闭锁术后，先天性巨结肠术后，先天性隔疝术后，小肠造瘘术后等;PICU 46株，包括重症脓毒症16株(34.8%)，外伤6株(13.1%)，及糖尿病、血液病等。
2.4 分离株的时间分布
2009年1月至2015年12月儿科血培养假丝酵母菌分离株数及构成比见表1。白假丝酵母菌分离率最高(40.3%)，近平滑假丝酵母菌次之(35.2%)。
2.5 药敏试验
白假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌对5种常用抗真菌药物的敏感性见表2，其他假丝酵母菌未列入表中。
3 讨论
近年来由于大量广谱抗生素、免疫抑制剂在临床的广泛使用，导致菌群失调和二重感染，使得真菌血流感染的发生率逐年增多，真菌的耐药率也呈上升趋势，真菌的耐药性已引起人们的广泛**************[4]。导致儿童真菌性脓毒症的高危因素较多，目前国内外报道主要包括早产、低出生体重、长期广谱抗生素应用、中心静脉置管、机械通气、长期静脉营养、外科手术、入住ICU时间等[5,6,7,8]。
本组研究表明，儿童假丝酵母菌血流感染总体仍以白假丝酵母菌为主(40.3%)，但以近平滑假丝酵母菌为代表的非白假丝酵母菌类的比例逐渐增加，近平滑假丝酵母菌分离率高达35.2%，光滑假丝酵母菌为9.1%，热带假丝酵母菌为5.1%。研究表明，光滑假丝酵母菌多发生在使用广谱抗生素时，尤其是第三代头孢菌素、万古霉素和静脉营养的患儿[6]。文献报道，近平滑假丝酵母菌的感染常与导管相关，导管技术的应用是血液真菌感染易感因素之一[7,8]。这是由于一方面念珠菌黏附能力强，极易在中心静脉导管表面定植，通过导管输入的高营养液又进一步促进其生长，因此，临床在怀疑患儿中心静脉导管相关性真菌感染时，应将导管及时拔出或更换;另一方面，近平滑假丝酵母菌多存在于机体的皮肤表面，可通过医疗行为由医护人员的手部传递给免疫力低下的患儿，因此，加强医护人员的手卫生，可有效控制医院获得性近平滑假丝酵母菌感染。
血液中检出真菌是诊断患者血液真菌感染的有力证据，即血培养是诊断真菌血症的"金标准"，快速鉴定真菌并进行药物敏感试验，对患者的抗感染治疗至关重要。念珠菌感染血培养阳性率为40%～60%，是新生儿念珠菌感染的主要诊断方法[9]。而事实上，由于真菌在血液中存在一过性和难培养的特性，以及临床标本送检的滞后性等原因，常导致血液真菌培养的阳性率偏低。此外，由于新生儿血培养采血量较少，也是引起假阴性的原因。由于真菌对糖代谢能力较弱，CO2产生量少，且酵母样真菌对营养条件有特殊要求，出现阳性报警时间较长。本组资料中，假丝酵母菌阳性总体报警时间为(36.17&plun;19.69) h;白假丝酵母菌为(34.15&plun;20.88) h，最长84 h;近平滑假丝酵母菌为(40.28&plun;20.24) h，最长可达127.6 h，这与文献报道[10]相同。由于真菌培养需要时间较长，因此临床疑似真菌感染时，可适当延长培养时间以提高真菌检出率。
本研究表明，真菌血流感染可发生在儿童的各个年龄段，但以新生儿科为主，占52.3%。新生儿真菌性脓毒症的高危因素较多，目前报道主要包括早产、低出生体重、长期广谱抗生素应用、中心静脉置管、机械通气、长期静脉营养、外科手术等[11,12,13]。本组资料中，早产儿85株占新生儿的92.4%，其中低和极低出生体重儿37株，占早产儿的43.5%，表明小胎龄、低出生体重的早产儿仍是真菌性脓毒症发生的主要群体;另外，本研究中早产儿合并新生儿肺炎20株(23.5%)、合并新生儿呼吸窘迫综合征9株(10.6%)，这些患儿需要更多的有创操作及监护。本组92例新生儿均行机械通气治疗，均行深静脉置管，均在真菌感染前使用过2种以上广谱抗菌药物治疗，由于上述这些高危因素的存在，导致新生儿病房是真菌血流感染的高危病区，而早产儿及其中的低出生体重儿是真菌血流感染的高危对象。新生儿外科以先天性疾病术后为主，如食管闭锁术后，先天性巨结肠术后，先天性隔疝术后，小肠造瘘术后等。本组176株假丝酵母菌分离自PICU 46株(26.1%)，且以重症脓毒症为主，这是由于PICU患儿一是住院时间长;二是患儿常带有多种体腔和血管内插管，进行各种有创监测和治疗，易造成皮肤和黏膜等解剖生理屏障损害，使得正常定植的条件致病真菌，以及环境中的真菌侵入血流而感染;三是长期使用广谱抗生素和糖皮质激素为另一重要医源性因素，这是因为在临床治疗原发病时，常将重点放在预防和治疗细菌感染，疗效不佳时就频繁更换抗生素，使肠道内生态平衡破坏，真菌在肠道内大量生长繁殖，进而为侵入血流创造了条件，同时不恰当使用糖皮质激素，可使机体免疫力受到抑制，防御系统遭到破坏，从而促进真菌生长[14]。
目前，儿童侵袭性真菌感染的治疗药物和成人一样，主要包括两性霉素B、类(氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑)、嘧啶类及棘白菌素类。两性霉素B虽然耐药性低，是首选的治疗药物之一，但因其具有一定的肾毒性，对处于生长发育期的儿科患者危害更大，从而限制了其临床应用;氟康唑因半衰期较长，亲脂性低，具有较好的渗透性，不良反应较少，可口服和静脉使用，且价格相对低廉，是理想的治疗和预防性药物[15]，缺点是克柔念珠菌对其天然耐药，光滑念珠菌呈剂量依赖性耐药;伏立康唑相比氟康唑抗菌谱较广，可用于氟康唑耐药的克柔念珠菌、光滑念珠菌的治疗，但其在新生儿应用中的疗效和安全性均有待进一步研究;氟胞嘧啶由于其毒性较大，无口服剂型，单一使用容易耐药，故不推荐应用于儿童尤其是新生儿。本组资料显示，两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和氟胞嘧啶对假丝酵母菌的整体敏感性均>93%，尤其氟康唑对分离率较高的白假丝酵母菌和近平滑假丝酵母菌敏感率>95%，所以临床怀疑真菌感染的高危患儿，可使用氟康唑进行早期经验性抗真菌治疗，以减少真菌性脓毒症的发生。因本研究检出5株氟康唑天然耐药的克柔假丝酵母菌，16株剂量依懒性耐氟康唑的光滑假丝酵母菌，所以在实施预防用药和早期经验性治疗时，如果临床治疗效果不佳，应考虑耐药菌株感染的可能，及时调整治疗方案。棘白菌素类为新型抗真菌药物，通过抑制真菌细胞壁的1，3-β-D 葡聚糖的合成，破坏真菌细胞壁结构的完整性，从而打破细胞渗透压的平衡，使真菌细胞溶解死亡，因其独特的作用机制，广谱的抗菌效果，无交叉耐药性，以及较高的耐药性，最新的真菌感染治疗指南首选棘白菌素类药物，目前临床应用较广的有卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净[16]。
由于本组真菌血流感染资料中以新生儿科的早产儿为主，鉴于新生儿真菌性脓毒症的临床表现和其他细菌性脓毒症相似，无特异性，早产儿主要表现为频繁呼吸暂停、反应差、拒乳、灌注差、喂养不耐受等。因真菌性脓毒症可累及多个脏器，若累及中枢，多预后不良。目前微生物培养仍是确诊的金标准，但由于其用时较长，且存在假阴性可能，容易导致漏诊而延误治疗。另外，早产儿真菌性脓毒症的治疗周期长，难度大，故对其的预防已引起极大**************，预防的对策主要有三方面[17,18]：一是针对普通感染的防控措施，如加强医务人员手卫生，环境物品消毒和隔离等;二是针对侵袭性真菌感染多种高危因素的措施，尽早使用肠内营养，减少广谱抗菌药物(特别是头孢菌素)和皮质激素的使用，对中心静脉导管进行集束护理等;三是药物预防。英美等发达国家NICU应用氟康唑预防性治疗被作为标准化的临床措施。Kaufmen等[19]研究发现，使用抗真菌药物预防性治疗，即针对住院后的早产儿静脉给予氟康唑3 mg/kg，每3天1次维持2周，以后隔天1次维持2周，最后每天1次维持2周，能够显著降低患儿真菌定植和侵袭性感染的机会，同时联合使用两性霉素B，可以减少氟康唑的使用量和耐药菌株的出现。
综上所述，我院儿童血液假丝酵母菌感染可发生在各年龄段，总体上仍以白假丝酵母菌为主，但近年来以近平滑假丝酵母菌为主的非白假丝酵母菌感染呈显著增长的趋势，已成为导致我院血液假丝酵母菌感染的主要原因之一，这种假丝酵母菌的菌种变化趋势应引起临床**************。以氟康唑为代表的5种监测的抗真菌药物对常见的几种假丝酵母菌敏感性均较高。氟康唑仍可首选用于血液假丝酵母菌感染的经验性用药。对血液真菌性脓毒症患儿，单凭血液真菌培养临床用药可能会错过最佳治疗时机，因此对具备发生真菌感染高危因素的、结合临床表现、体征、真菌寄殖证据，应根据年龄特点积极治疗基础疾病，对疑有继发性真菌感染达到经验性早期治疗标准的，临床医生可早期预判及时治疗，如可能为导管相关性感染，应及时拔出导管，根据药敏试验合理选择抗真菌药物，适时调整治疗方案，做到早预防、早诊断、早治疗。
