李建民,陈长香,赵雅宁,王大永,朱军,付 作者单位：063000 河北省唐山市，华北煤炭医学院附属医院神经外科 ;华北煤炭医学院护理系 ;河北省唐山市工人医院神经外科
【摘要】目的 探讨川芎嗪对沙鼠前脑缺血再灌注后学习记忆的影响及其机制。方法 40只蒙古沙土鼠随机分为4组，假手术组、脑缺血组、对照组、川芎嗪治疗组，每组10只。阻断沙土鼠双侧颈总动脉造成前脑缺血模型，4PTT(4pellet taking test)旱路迷宫法对沙鼠前脑缺血再灌注7 d后的学习记忆功能进行评定，HE染色方法观察海马CA1区神经元形态变化，免疫组织化学法观察海马CA1区胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)阳性星形胶质细胞的反应。结果 假手术组未见坏死神经元，神经元密度(27.64.3)HS，脑缺血组中坏死神经元显著增多，神经元密度明显下将(6.81.7)HS(P<0.05);与脑缺血组比较，川芎嗪治疗组坏死神经元显著较少，神经元密度增加(16.92.6)HS(P<0.05)。CA1区星形胶质细胞活性在脑缺血组中(7.71.8)HS明显高于假手术组(3.91.2)HS(P<0.05);与脑缺血组比较，川芎嗪治疗组星形胶质细胞活性进一步增强(P<0.05)。4PTT旱路迷宫实验显示，脑缺血组中沙鼠参照记忆指标和工作记忆指标与对照组有明显的差异(P<0.05);川芎嗪治疗组上述指标显著改善(P<0.05)。结论川芎嗪能改善前脑缺血沙鼠的学习记忆能力，与其对星形胶质细胞活性调节有关。
【关键词】 川芎嗪 学习和记忆 缺血再灌注 星形胶质细胞
【Abstract】 Objective To investigate the effect and the possible protective mechani of Tetramethylpyrazine(TMP)on learningmemory function after forebrain ischemia reperfusion injury in gerbils.Methods 40 gerbils were randomly divided into four groups：sham operation group，ischemia group，ischemia+NS treatment group and ischemia+TMP treatment group.Transient forebrain ischemia model was formed by bilateral common carotid artery occlusion.The learning and memory function was evaluated 7d after ischemiareperfusion by 4PTT dry path maze method.The changs of neuron morphous in hippocampal CA1 region were observed by HE staining.Astrocytes activity(glial fibrillary acidic protein，GFAP)was measured by immunohistochemistry.Results No degenerated and necrotic neurons were found in sham group.The density of neurons in ischemia group(6.81.7) was significantly decreased，as compared with that in sham group(27.64.3，P<0.05).The density of neurons in TMP treatment group(16.92.6)was obviously increased，as compared with that in ischemia group(P<0.05).The levels of GFAP in ischemia group(7.71.8)were significantly higher than those of sham group(3.91.2，P<0.05);the levels of GFAP in TMP treatment group were obviously higher than that of ischemia group(P<0.05).There were significant differences in the indexes of referencememory and working memory between sham group and ischemia group.The indexes in TMP treatment group were improved obviously(P<0.05).Conclusion TMP can improve the learningmemory function after forebrain ischemia reperfusion damage in gerbils.One of molecular mechanis is related to its regulation effects on astrocytes activity.
【Key words】 Tetramethylpyrazine;learningmemory;astrocytes;cerebral ischemia reperfusion
川芎嗪是中药川芎的有效成分，具有扩张血管、改善微循环、抑制血小板聚集作用，并能有效清除自由基，抗脂质氧化及作为钙拮抗剂起作用，在治疗缺血性脑血管病方面有一定疗效[1]。但川芎嗪对脑脑缺血后引发的高级功能障碍是否具有改善作用尚需深入研究。本研究利用沙鼠的前脑缺血模型，用4PTT(4pellet taking test)旱路迷宫及组织学方法，从海马区神经元和星形胶质细胞的变化角度，来探讨川芎嗪对学习记忆的影响。
1 材料与方法
1.1 动物模型制备
采用Kirino的双侧颈总动脉夹闭法[2]制作10 min沙鼠前脑缺血模型，脑缺血中、后监测肛温，手术中维持体温在36.8～37.2℃。
1.2 分组及给药方法
40只雄性蒙古沙土鼠(上海生物制品有限公司实验动物中心)，体重60～80 g，9～12周龄，随机分为：假手术组，脑缺血组，对照组(与川芎嗪等量0.9%氯化钠溶液)，川芎嗪治疗组，每组10只。川芎嗪组于脑缺血后即刻尾静脉注射川芎嗪14.4 mg/kg，1次/d，连续7 d。对照组注射等量0.9%氯化钠溶液。
1.3 学习记忆能力测试
脑缺血7 d后进行采用4PTT旱路迷宫进行学习和记忆行为功能检测。检测指标为：(1)达到完成标准所需的实验次数(TRCS);(2)每次完成实验所用的时间(TCFP);(3)每次实验中从开始到吃掉第一个食物所用的时间(TCTP);(4)每次实验中的非正确错误数(IE)。(1)、(2)、(3)反映参照记忆，(4)反映工作记忆。
1.4 HE染色
4组动物在4PTT旱路迷宫实验结束后，戊巴比妥钠麻醉(40 mg/ kg)，用40 g/L多聚甲醛经左心室灌注固定后取脑，后固定24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。选择海马部位切片，片厚5 m。切片二经甲苯脱蜡，梯度乙醇降至水，甲苯胺兰染色。每只鼠连续3张冠状背侧海马切片，图象分析仪，作定量分析(美国BioRad公司)。
1.5 免疫组化
标本多聚甲醛固定，经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，按试剂盒说明进行GFAP(北京中山公司)免疫组化染色(SABC法)，步骤如下：3%过氧化氢孵育5～10 min，室温5～10 min。蒸馏水洗3次。滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min，甩去多余液体，不洗。滴加兔抗鼠胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗体(IgG)，4℃过夜，0.1 mol/L PBS洗2 min3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃，20 min，0.1 mol/L PBS洗2 min3次。滴加SABC，20～37℃，20 min，0.1 mol/L PBS洗5 min4次。DAB显色，苏木精复染。多媒体彩色病理分析系统计数。
1.6 统计学分析
应用SPSS 12.0统计软件，计量资料以s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 学习记忆测试结果
与假手术组比较，脑缺血组中沙鼠TCTP、TCFP、TRCS、IE和CE都有明显差异(P<0.05);与脑缺血组比较，对照组中上述指标无明显变化，而川芎嗪治疗组有较大的改善，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。表1 4组参照记忆与工作记忆指标比较(略)注：与假手术组比较，*P<0.05;与脑缺血组比较，#P﹤0.05
2.2 病理结果(HE染色)
假手术组，海马CA1区神经元结构完整，排列整齐致密，未见变性坏死的神经元;缺血组与对照组海马CA1区神经元大部分变性坏死，细胞间隙加大，细胞核浓缩、深染，溶解、消失;川芎嗪治疗组海马CA1区存活的神经元较脑缺血组明显增多，大部分为结构完整的神经元;4组神经元密度差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
2.3 GFAP免疫组织化学结果
GFAP阳性染色显棕黄色，位于胞浆内，周围有放射状突起，突起或细或粗，或长或短，或无分支或有分支，形态大致如蜘蛛样。阴性对照切片未见GFAP免疫反应产物。假手术组仅见少量GFAP染色阳性细胞，细胞数目很少，染色浅，突起细、短;脑缺血组和对照组海马CA1区GFAP表达较多、深染，细胞突起变长、增粗和分支增多，阳性细胞数目也增多;川芎嗪治疗组GFAP阳性星形胶质细胞数目明显增多，染色更深，突起增粗，增长，分枝更多，甚至交织成网。见图1、表2。表2 4组海马CA1区神经元(略)注：与假手术组比较，*P﹤0.05;与脑缺血组比较，#P﹤0.05
3 讨论
本实验中，应用4PTT旱路迷宫测试系统，全面、客观的对实验动物的空间认知、记忆加工过程进行评价，结果显示：脑缺血再灌注后沙鼠的学习记忆能力明显受损，川芎嗪组沙鼠参照记忆和工作记忆均较缺血组明显改善，说明川芎嗪提高了沙鼠空间认知、记忆加工能力，这与刘瑞芬等[3-5]研究结果一致。
本实验结果显示，脑缺血再灌注后海马CA1区神经元数目显著减少，川芎嗪可明显较少变性坏死的神经元数量，提高存活神经元密度;与此相对应，川芎嗪同样显著提高星形胶质细胞标记物GFAP的表达，由此我们分析川芎嗪可能通过促进星形胶质细胞活化增生，减少神经元损伤来来实现的。作为中枢神经系统的骨架细胞，星形胶质细胞通过合成和分泌多种细胞因子，对神经元的生存、分化起重要作用;同时星形胶质细胞表达多种神经递质和调质参与神经元的信息传递。近期研究发现，中枢神经系统疾病中应激活化的星形胶质细胞发挥了内源性的神经保护作用，脑缺血1～21 d，脑缺血区的星形胶质细胞活跃，这些早期的变化可增强神经元对低糖和缺氧的耐受性，并且通过调节细胞外液K+浓度、摄取谷氨酸、释放谷胱甘肽以及表达神经营养因子对缺血性脑损伤的发展和转归具有重要意义[6，7]。但是，持续活化的星形胶质细胞可通过释放炎性因子、氧自由基、影响谷氨酸和自由铁的代谢等加重神经元的损伤[8，9]。因此，有关利用星形胶质细胞内源性保护作用的时间窗问题尚需深入探讨。
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