回应韩春雨的回应
方舟子老师：您好。
针对您昨天的文章，韩春雨回应了一些所谓的实验细节，见
http://tieba.baidu.com/p/4645810480?pid=93027569268&cid=0&from=prin#93027569268，想必您也看到了。
他公布的所谓“高超的实验技巧”，包含三点：一是质疑者的细胞都污染了；
二是要做银染；三是要做GFP敲入（knock－in，KI）实验证明NgAgo可以work。
回应如下：
一，保证实验室的细胞没有支原体污染，不是什么高超的实验技巧，而是一
个正常实验室最基本的操作规范，比如每三个月定期检测支原体污染。
二，银染并不是什么高深的实验，而是使用了几十年的常规技术，按照
protocol配好buffer，把胶扔进去染色，没有人不会做。银染非常灵敏，反应速
度很快，容易出现信号饱和，不适合定量，容易产生假阳性条带。韩春雨的
Nature Biotechnology文章里面测试了50个位点切割基因组，每个都work，无一
例外，效率最低的也有15%（补充数据图5），高的有30%（图4）。这样的效率要
银染才能看到？普通的agrose胶和EB染色看不到？
三，他的回应又建议直接做GFP的敲入，证明NgAgo可以work。这完全不合理：
单个位点的切割比KI要简单，为何不先做切割，然后通过测序直接证实切割。而
做GFP的敲入，通过荧光来看，难免又会有假阳性！
还有两点：
一是单转guide DNA引起的GFP下调的假阳性，有可能是类似RNAi的
antisense effect，看他的序列都是antisense的。
二是重复他实验的实验室，不少是自己合成的NgAgo基因，自己已经做了密
*****子优化，但是仍然重复不出来。
附韩春雨提供的实验细节：
我目前仍只有一个做实验的小团队，无法做好服务性工作，一天十几个个电
话我都是重复的以下内容：----所谓
高超的技巧，其实也很简单，细胞做好检测，不要有寄生菌污染，不要有支
原体污染（Ago系统对污染特别敏
感---特别是单转guide假阳性---我非常确定在没有污染的情况下，单转
guid不会影响GFP表达，假阴性也大多因为细胞污染，假阳性和假阴性我都遇到
过，国内买的细胞我就不吐槽了），转染用的质粒质量要好（可用30ngGFP转细
胞，若是均一且效率高表明质量好，强弱不均一则表明质量差，越不均一表明质
量越差），guide磷酸化完全（没有磷酸化不能load和切割---谢谢印证我的Fig2
结果，至于怎么检测，自己跑个PAGE看看---），特别的，对于Fig4，也是几乎
惟一算是有难度的，就是控制转染时的细胞密度和用血清控制细胞生长，时间稍
长，毕竟NgAgo未经过系统的密*****子优化---照着online method上protocol for
genome editing and T7E1做（小经验，PCR最好不要有引物二聚体，如果引物二
聚体多请重设引物；PCR产物直接回收最好不跑胶回收，可能跟ago切24bp有关，
设好对照！）---银染分辨率高，可以排除T7E1假阳性，能做出预期条带后请用
PCR产物去测序--------欢迎大家广泛使用此系统，并分享成功经验和失败教训。
附，addgen上的质粒，可以直接用作基因组编辑。再次强调，不加NgAgo，就能
抑制GFP，是假阳性，是细胞出问题了（谢天谢地不但我自己而且审稿人也有这
个对照）出现假阳性的细胞切基因组就没戏了。对于Fig4，若是不习惯做银染，
也可
以直接做KI：doner 用GFPcoden+polyA signal，前后加几个保护性的碱基
---从GFP-N1扩出来连到T-vector上，再从此doner-Tvector上扩（防止GFP-N1污
染的假阳性）出来纯化，500-800ng共转（for each well of 24 well plate）。(SciFans.Net)
