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近日，美国波士顿大学生物医学工程系的Ji-Xin Cheng教授与浙江大学物理系研究团队、美国伊利诺伊大学厄本那香槟大学Gabriel Popescu教授合作，在国际顶尖学术期刊《光：科学与应用》发表题为基于红外光激发分子振动的键选瞬态相位（BSTP）成像技术的高水平论文。来自波士顿大学生物医学工程系的Delong Zhang, Lu Lan为本文章的共同第一作者，此外，中科院上海光机所、波士顿大学光子学中心亦对此研究作出了贡献。该文主要针对生命科学与材料领域中成像问题展开了研究，开发了一种键选瞬态相位（BSTP）成像技术，该技术通过红外光激发分子振动，从而可以通过衍射相显微镜检测到的相移瞬态变化。文中通过开发时间门控的泵式探头照相机系统，演示了以50Hz帧频对活细胞进行BSTP成像，成像具有高频谱保真度，亚微秒级时间分辨率和亚微米级空间分辨率。
在生物成像领域，传统的光学明场显微镜是依赖吸收作为强度图像中的主要对比机制，对于具有低吸收或散射的样品（例如生物细胞），会产生弱强度调制和低对比度的图像，难以满足高精度研究的要求，近年来科研人员利用透明样本会显着改变探测光的性质，通过在入射光和散射光之间引入一个附加的正交相移，来将样品的相移转换为亮度变化，从而可以研究透明的、未标记的样品。但是，穿过样品的光的相位对化学成分非常不敏感，难以应用成像来理解复杂系统中的分子相互作用，缺乏揭示分子信息的能力，为了实现这一目标，已经报道了将相位成像与荧光标记相结合，然而，荧光标记具有基本的局限性，包括光致漂白，生物结构的扰动以及不能标记小分子，使得其在生命科学与材料领域中成像领域中难以得到广泛的应用。
研究表明，固有分子键振动可通过红外（IR）吸收或拉曼散射光谱法用作化学成像的无标记对比。与拉曼散射相比，红外吸收的效果要强得多，观察到的是样品对光的衰减。同时常用化学物质的红外光谱数据库也十分成熟。但是，由于与可见光谱相比波长较长，因此直接红外成像的空间分辨率较差。此外，很难从其他衰减效应（例如散射和反射）中提取固有吸收特性。这些缺点限制了红外成像的潜力。本文的研究团队注意到，来自红外吸收的能量会导致样品温度升高，从而通过热光效应改变其折射率，进一步改变光程长度。这种变化可以通过相位成像进行测量和量化，以提供样品的固有分子光谱。基于此概念，文中介绍了一种键选性瞬变（BSTP）显微镜，该显微镜通过脉冲红外光扰动将化学信息引入相成像。由红外吸收引起的温度升高是短暂的，在几微秒内消失。但是，当前的相位成像设备的成像速度高达每秒几千帧，仍然不足以记录这种相移的瞬态变化。为了解决这一问题，Ji-Xin Cheng教授团队研究开发了一种可捕获瞬态相移变化的定时门控泵式摄像机系统。具体而言，通过利用亚微秒级的激光脉冲来探测由纳秒级脉冲红外激光器引起的相移的瞬态变化，实现了亚微秒级时间分辨率的宽范围BSTP成像。
图1 BSTP的成像原理。探测光穿过样品并在相机处与参考光束相互作用，然后基于干涉图检索样品的相位图像，接下来，样品处的红外脉冲在A点引起振动吸收，使局部温度升高T，改变了局部的折射率，使其与点B相比，局部光学相移发生改变，点B在该波长处没有吸收峰。然后通过在相邻的热相和冷相帧之间相减获得相移的瞬时变化。通过调节红外脉冲的频率，可以获取每个像素处的光谱。
图2 BSTP显微镜系统。（a）BSTP显微镜相同结构。AOM：声光调制器。P1，P2：抛物线形金镜。OL：物镜。 L0，L1，L2：镜头。G：光栅。PH：针孔。（b）时序图。 td：探测脉冲相对于每个脉冲串中红外脉冲开始的延迟。（c）时钟层次。
图3 BSTP信号的特征。（a）油膜样品的BSTP图像。 每个图像有六个红外脉冲，间隔为6.67 s。波数为2950cm-1。（b）BSTP信号的时间轮廓。（c）与标准FTIR频谱（线）相比，BSTP信号的频谱保真度。（d）BSTP信号与泵浦功率的关系。BSTP信号在不同的红外功率下的线性拟合曲线。（e）BSTP信号与探测功率的关系。不同探测功率下的线性拟合后的BSTP信号。（f）不同探测功率下BSTP信号拟合曲线的信噪比。
图4 聚氨酯颗粒的BSTP成像。（a）聚氨酯颗粒的定量相图。（b）、（c）聚氨酯颗粒BSTP成像在2980cm-1的吸收峰和2700cm-1的非共振峰。（d）聚氨酯颗粒的BSTP光谱图（上）和测得的标准FTIR光谱（下）。（e）较小的聚氨酯颗粒的BSTP（蓝线）和原始相（黑线）。
图5 活体细胞3T3的BSTP成像。（a）细胞的原始相图像。（b）~（e）3T3细胞的BSTP成像分别在2850、2930、2950cm-1和2700cm-1处的共振峰，（b）中的虚线圆表示红外照明区域。（f）BSTP强度曲线，如c中的虚线箭头所示。红线：高斯拟合结果。比例尺：10m。
图6 DMSO与油的界面的BSTP成像。（a）DMSO和油样品的实测FTIR光谱。（b）DMSO与油之间界面的原始相图像。（c）~（f）在2850、2912、3000和3100cm-1处红外激光下的界面的BSTP图像。（来源：科学网）
相关论文信息：
https://doi.org/10.1038/s41377-019-0224-0 
